polylc 聚磺乙基簡介

聚磺乙基 A™

- 用于肽的陽離子交換-

這種強(qiáng)陽離子交換 (SCX) 材料是專門為多肽的 HPLC 開發(fā)的。在 pH 2.7-3.0 時(shí)，肽會(huì)失去 (-) 電荷并具有凈 (+) 電荷。因此，PolySULFOETHYLA™是反相 (RPC) 的通用替代品，通過電荷差異而不是極性來分離肽。與其他基于磺丙基 (SP-) 基團(tuán)的 SCX 材料相比，PolySULFOETHYLA™是異常親水的。這最大限度地減少了與肽的疏水相互作用，具有高回收率和更少的峰拖尾。容量也很高，可以更好地保留和分離胰蛋白酶消化物中的弱堿性肽。這種離子交換材料的容量是同類 RPC 柱的 4 倍。因此，離子交換應(yīng)該是多步純化的第一步。將聚磺乙基 A™ 用于：

1) 多肽混合物的多維 HPLC，例如 蛋白質(zhì)組學(xué)分析中的胰蛋白酶消化物（包括 iTRAQ® 和 ICAT®* 反應(yīng)產(chǎn)物）。

2) 從天然產(chǎn)物中分離肽。

3) 合成肽的QC和純化。

4) 從胰蛋白酶消化物中選擇性分離二硫鍵連接的肽、磷酸肽和 C 端片段。

5) 肽消化物圖譜（胰蛋白酶、V8、CNBr 等）。

蛋白質(zhì)也可以在PolySULFOETHYL A™色譜柱上運(yùn)行；在 pH 值為 3 時(shí)，幾乎可以保證保留。一個(gè)例子是在以親水相互作用(HILIC) 模式操作的 PolySULFOETHYL A 色譜柱上分析肺表面活性劑蛋白。

肽應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)材料是 300-?，3- 或 5-µm。200-? 材料的容量增加約 25%，是 iTRAQ® 反應(yīng)混合物的磷酸肽分離和分級(jí)分離的優(yōu)選。對(duì)于蛋白質(zhì)，使用 1000-? 材料或 3-µm、1500-? 材料。

蛋白質(zhì)組學(xué)

胰蛋白酶消化物的 SCX-RPC：  沒有單一的分析方法足以識(shí)別一個(gè)非常大的集合中的每個(gè)蛋白質(zhì)。一種廣泛使用的方法（自下而上"蛋白質(zhì)組學(xué)）是用胰蛋白酶消化混合物中的所有蛋白質(zhì)，并將所得肽分成足夠小的組，以便通過 MS/MS 或 QTOF-MS 進(jìn)行鑒定。對(duì)于少于 200 個(gè)肽段的樣品，反相 HPLC 通?？梢蕴峁┳銐虻姆直媛?，但較大的樣品必須首先通過補(bǔ)充方法分成子集。實(shí)現(xiàn)此目的的最佳方法是使用強(qiáng)陽離子交換 (SCX)通過荷質(zhì)比的差異將消化物分成幾部分。然后可以通過 RPC-MS 分別分析每個(gè) SCX 餾分。該序列已用于鑒定樣品中多達(dá) 12,000 個(gè)肽段。我們的聚磺乙基天冬酰胺™材料是好的，大多數(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)室都在使用。最好在 pH 2.7-3.0 的鹽梯度下進(jìn)行，此時(shí)羧基失去負(fù)電荷，幾乎所有肽都帶凈 + 電荷。在典型的復(fù)雜胰蛋白酶消化中，大約 65% 的肽具有 +2 的凈電荷（由于堿性 N 末端和 C 末端的 Lys- 或 Arg-）。線性鹽梯度會(huì)導(dǎo)致這些洗脫物聚集在幾個(gè)餾分中，從而破壞了色譜第二維的目的。相反，使用 2 段線性梯度洗脫色譜柱；在大部分梯度時(shí)間內(nèi)使用淺梯度（至約 180 mM 鹽）以分散 +1 和 +2 肽，并使用陡峭梯度至約 0.5 M 鹽以洗脫 +3 和 +4 肽。

在線與離線 SCX 分餾：PolySULFOETHYL A™填充毛細(xì)管可以通過增加鹽濃度的步驟進(jìn)行洗脫，每個(gè)餾分進(jìn)入脫鹽 RPC 捕集柱或直接進(jìn)入 RPC 毛細(xì)管。這種安排通常稱為MuDPIT。另一種方法是離線收集餾分，然后將它們分別注入 RPC 毛細(xì)管（“分離的MuDPIT "）。
在線優(yōu)勢：更容易處理極小樣本并實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。
離線優(yōu)勢：
1) 可以用更簡單的設(shè)備進(jìn)行。
2) 流動(dòng)相可以含有 20-25% ACN，可以在 RPC 步驟之前去除。這提供了更尖銳的峰。結(jié)果：更高百分比的肽在單個(gè)收集的級(jí)分中洗脫，而不是在兩個(gè)相鄰級(jí)分之間分離（在有利的情況下，> 75% 的總肽在真正復(fù)雜的胰蛋白酶消化物中）。這增加了肽段鑒定的成功率，因?yàn)槟锌赡茉趩蝹€(gè)部分中獲得可檢測量（~ 15 fmol）的低豐度肽，并且不太可能與來自高豐度的肽共享該部分蛋白質(zhì)（可以抑制其在 MS 步驟中的電離）。
3) SCX 色譜柱可以比 RPC 毛細(xì)管大。這允許加載更多樣品，從而更有可能檢測到 > 15 fmol 的每種肽。它還允許使用更快的流速。這有助于收集大量餾分（在某些實(shí)驗(yàn)室多達(dá) 100 個(gè)）。這反過來又增加了識(shí)別低豐度肽的機(jī)會(huì)，因?yàn)樗鼈儾惶赡芘c高豐度肽共享一部分。例如，甘等人。( Proteomics 5 (2005) 2468) 通過收集 40 個(gè) SCX 級(jí)分鑒定出比收集 25 個(gè) SCX 級(jí)分多 2.8 倍的蛋白質(zhì)。
4) 可以使用線性梯度代替階梯梯度。這增加了分辨率。

結(jié)論：離線餾分收集是*的。Kevin Blackburn (NC St. U) 表示*，他通過離線餾分收集識(shí)別出的肽比在線多 3 倍，所有增加的肽都代表低豐度的肽。
*（ASMS '00 和 '01）。

完整蛋白質(zhì)的預(yù)消化分餾：這在以下幾種情況下非常有用：
1) 樣品中的蛋白質(zhì)太多，即使是 SCX-RPC 的 2-D 組合也不足以充分分餾胰蛋白酶消化物以識(shí)別低豐度肽。
2) 樣品中含有一些豐度比其他蛋白質(zhì)高得多的蛋白質(zhì)。將它們收集在它們自己的部分中將排除它們的胰蛋白酶片段掩蓋來自低豐度蛋白質(zhì)的肽。請(qǐng)參見下面的 THP-1 單核細(xì)胞示例。
3）雖然蛋白質(zhì)的數(shù)量有限，感興趣的蛋白質(zhì)豐度低，如果在消化前不與高豐度蛋白質(zhì)分離，就會(huì)被掩蓋。參見組蛋白 H4 和 H1.5 的示例。
4) 在消化前將蛋白質(zhì)分配到組分中增加了通過一種以上肽識(shí)別特定蛋白質(zhì)的機(jī)會(huì)。請(qǐng)參見以下示意圖：

用于此目的的通用方法包括疏水相互作用 (HIC) 和離子交換 (IEX) 色譜法。HIC 是一種通過疏水性差異分離水溶性蛋白質(zhì)的好方法 [下]。與反相色譜不同，它是一種非變性模式。然而，疏水蛋白很難在 HIC 中保持在溶液中。

相比之下，IEX 可以在流動(dòng)相中使用有機(jī)溶劑進(jìn)行，使其與所有蛋白質(zhì)具有前瞻性兼容。參見蛋白質(zhì)與有機(jī)溶劑的離子交換。

串聯(lián)使用陰離子交換柱和陽離子交換柱會(huì)產(chǎn)生保留所有蛋白質(zhì)的混合床排列。下面的示例是 THP-1 單核細(xì)胞沉淀的粗裂解物，使用PolyCAT A™和PolyWAX LP™色譜柱獲得。具有揮發(fā)性鹽的梯度是可能的。

膜蛋白的HILIC：HILIC 對(duì)膜蛋白非常有效，如下例所示。有時(shí)可以使用揮發(fā)性溶劑。組蛋白最好在HILIC 模式下使用PolyCAT A™色譜柱進(jìn)行分離。

從胰蛋白酶消化物中分離磷酸肽和其他類型的肽：由于 N 端和 C 端的 Lys 或 Arg 殘基，典型的胰蛋白酶肽在 pH 2.7-3.0 時(shí)具有 +2 的凈電荷。磷酸基團(tuán)的連接將肽的凈電荷降低至+1。因此，最早洗脫的 SCX 級(jí)分富含磷酸肽，以及 C 端和封閉的 N 端片段。PolySULFOETHYL A™的 200-? 孔徑版本比通常用于蛋白質(zhì)組學(xué)的 300-? 材料具有更高的表面積，并且可以合理地*地將 +2 肽從 +1 肽中拉出 [下圖]。博索萊爾等人。（美國國家科學(xué)院院刊 101(2004) 12130) 已經(jīng)使用這種方法從 HeLa 細(xì)胞裂解物的胰蛋白酶消化物中鑒定了 2000 多種磷酸肽。在各種研究中，一個(gè)非常復(fù)雜的胰蛋白酶消化物中大約 20-30% 的磷酸肽在這個(gè) +1 窗口中被洗脫。最近對(duì)這種方法的一個(gè)很好的研究是：JC Trinidad等人，Mol。細(xì)胞。蛋白質(zhì)組學(xué)5 (2006) 914。

在另一個(gè)交聯(lián)兩個(gè) +2 肽會(huì)產(chǎn)生凈電荷為 +4 的肽。因此，在非還原的胰蛋白酶消化物中，二硫鍵連接的肽比大多數(shù)其他肽的洗脫時(shí)間明顯晚。該方法已被用于選擇性地隔離它們。

膜和全細(xì)胞沉淀的問題：
1) 溶解樣品。
2) 從所得溶液中除去脂質(zhì)。
3) 在隨后的分餾過程中將膜和結(jié)構(gòu)蛋白保持在溶液中。

此類樣品可在室溫下用 4:1 的 HFIP [純] 和濃溶液在幾分鐘內(nèi)溶解。甲酸 (96-98%)。膜蛋白也可以用丙醇或含有 HFIP 的乙腈提?。▍⒖嘉墨I(xiàn)：J. Carroll 等人，PNAS 103 (2006) 16170）。這些溶劑避免了去污劑對(duì)下游分析方法的干擾。所得溶液中的脂質(zhì)可以通過 HILIC 模式下的 SPE 小柱去除；例如，item# SPEHY1203、TT200HEA 等。不保留脂質(zhì)（以及鹽和去污劑），但保留蛋白質(zhì)和肽。然后可以通過逐步增加水溶液來洗脫蛋白質(zhì)和肽。要在 IEX-HPLC 期間保持蛋白質(zhì)在溶液中，請(qǐng)使用 NaClO 4用于梯度并在流動(dòng)相中包括以下內(nèi)容：50 mM HFIP、20% ACN 和 20% PrOH。在情況下，使用 35% 的 ACN 和 35% 的 PrOH。或者，根據(jù)上述膜蛋白示例，在 HILIC 模式下使用PolyHYDROXYETHYL A™ 。
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ICAT®；iTRAQ®；MuDPIT :
ICAT: 如果您可以通過鑒定 2 或 3 個(gè)胰蛋白酶片段來確定蛋白質(zhì)的存在，那么鑒定其余部分是多余的。ICAT 的“AT"部分消除了蛋白質(zhì)中的大部分胰蛋白酶片段，從而可以從復(fù)雜的混合物中識(shí)別出更多的蛋白質(zhì)。在親和素柱親和純化之前，通常在PolySULFOETHYLA™上通過 SCX 對(duì)完整的消化物進(jìn)行分級(jí)分離。這可以清理樣品并消除多余的 ICAT 試劑，否則可能會(huì)使親和素的結(jié)合能力飽和。
iTRAQ：這有助于測量相對(duì)豐度，但不一定以 ICAT 的方式簡化混合物。與 iTRAQ 試劑反應(yīng)后，確保將 pH 值降至 3.0 或更低，并對(duì)混合物進(jìn)行脫鹽，以便在 SCX 中獲得良好的保留。
MuDPIT：參見上面關(guān)于在線與離線方法的討論。

蛋白質(zhì)組學(xué)策略中的常見缺陷：
1) 未能消除脂質(zhì)：這些會(huì)阻塞 RPC 柱并通常會(huì)產(chǎn)生干擾。使用 SPE-HILIC 小柱去除它們，或者使用含有 > 40% 有機(jī)溶劑的流動(dòng)相進(jìn)行離子交換。
2) 在胰蛋白酶消化過程中使用尿素、SDS 或 Gd.HCl：這些與 RPC 和/或 MS 不兼容。改用 30% 的 PrOH。參考：WK Russell等人  化學(xué)。73 (2001) 2682。
3) 胰蛋白酶化或 iTRAQ 反應(yīng)后未能調(diào)節(jié) pH：胰蛋白酶化和 iTRAC 衍生化在 pH 8 下進(jìn)行，而隨后的 SCX 在 pH 2.7-3.0 下進(jìn)行。未能調(diào)整 pH 值將導(dǎo)致樣品洗脫到空體積中。如果可能，使用 NH 4 HCO 3作為胰蛋白酶化緩沖液而不是 Tris，因?yàn)樗梢酝ㄟ^凍干法消除。
4) 樣品太咸：如果使用 SpeedVac® 去除 NH 4 HCO 3，將樣品連續(xù)干燥 3 次。對(duì) iTRAQ 反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行脫鹽比僅用 SCX 流動(dòng)相稀釋它們要好。
5) TFA 或 HFBA 的使用：一些作者建議在 SCX 的樣品溶劑或起始流動(dòng)相中使用它們。不！胰蛋白酶肽通常不保留在此類溶劑中。使用 5 mM KH 2 PO 4或 0.1% 甲酸或乙酸。6) SCX 色譜柱或毛細(xì)管過載： PolySULFOETHYLA™
色譜柱 每次進(jìn)樣推薦的最大肽裝載量如下：0.30-mm id，25µg；1.0 毫米內(nèi)徑，250µg；2.1 毫米內(nèi)徑，1.0 毫克；4.6 毫米內(nèi)徑，5 毫克。一些組超過這些水平高達(dá) 6 倍。這節(jié)省了勞動(dòng)力并產(chǎn)生了更濃縮的餾分。問題：

a) 列通常持續(xù) 1/6 的時(shí)間。
b) 峰更寬。這意味著在每個(gè)收集的部分中會(huì)有更多的肽。RPC 毛細(xì)管可能過載，導(dǎo)致識(shí)別的肽百分比較小。

結(jié)論：為您的樣品使用足夠大的 SCX 色譜柱。

含 2µm 顆粒的色譜柱 （孔徑選項(xiàng)：-01、-03、-10）

具有 3µm 顆粒的色譜柱 （孔徑選項(xiàng)：-006、-01、-03、-05、-10、-15）

具有 5µm 顆粒的色譜柱 （孔徑選項(xiàng)：-006、-01、-02、-03、-05、-10、-15）

具有 3µm 顆粒的毛細(xì)管* （孔徑選項(xiàng)：-006、-01、-02、-03、-05、-10、-15）**

帶有 5µm 顆粒的毛細(xì)管* （孔徑選項(xiàng)：-006、-01、-02、-03、-05、-10、-15）**

散裝材料 - 按克計(jì)價(jià)

固相萃取柱 - 10 包

項(xiàng)目編號(hào)	顆粒/孔徑	價(jià)格
SPEHY1201	12µm, 100?	110.00
SPEHY1203	12µm, 300?	110.00
SPEHY1215	12µm, 1500?	110.00
SPEHY2001	20µm, 100?	110.00
SPEHY2003	20µm, 300?	110.00

 

保護(hù)墨盒 - （注意：需要可重復(fù)使用的支架。請(qǐng)參閱下面的列表）

墨盒尺寸	項(xiàng)目編號(hào)	價(jià)格/克
10×1.0mm	GC1-HY02--	100.00
10×1.0mm	GC1-HY03--	85.00
10×1.0mm	GC1-HY05--	75.00
10×2.0mm	GC2-HY02--	100.00
10×2.0mm	GC2-HY03--	85.00
10×2.0mm	GC2-HY05--	75.00
10×3.0mm	GC3-HY02--	100.00
10×3.0mm	GC3-HY03--	85.00
10×3.0mm	GC3-HY05--	75.00
10×4.0mm	GC4-HY02--	100.00
10×4.0mm	GC4-HY03--	85.00
10×4.0mm	GC4-HY05--	75.00
20 x 4.0mm	GC4-HY03---2	90.00
20 x 4.0mm	GC4-HY05---2	80.00
上面的支架 （CPI 細(xì)節(jié)；內(nèi)螺紋入口，外 螺紋出口）	DGCH10 直接保護(hù)墨盒支架	60.00
上面的支架 （CPI 細(xì)節(jié)；內(nèi)螺紋入口，內(nèi) 螺紋出口）	IGCH10 Inline Guard 墨盒支架	60.00
10 x 10mm （需要 CH10 支架）	110GCHY03--	175.00
10 x 10mm （需要 CH10 支架）	110GCHY05--	160.00
10 x 10mm （需要 CH10 支架）	110GCHY12--	80.00
持有者	CH10	150.00
30 x 21.0mm	（問）	（問）