k-assay大鼠肌酸激酶 MB 同工酶 (CKMB) ELISA

用于定量測定血清、血漿、組織勻漿、細胞裂解液、細胞培養(yǎng)中的大鼠 CKMB上清液和其他生物液體。

kamiya目錄號編號KT-12247

僅供研究使用。

產品信息

大鼠肌酸激酶 MB 同工酶 (CKMB) ELISA

 目錄號編號KT-12247

 預期用途

試劑盒是一種夾心酶免疫測定法，用于體外定量測定血清、血漿、組織勻漿、細胞裂解液、細胞培養(yǎng)上清液和其他生物體液中的大鼠 CKMB。僅供研究使用。

 組件

需要但未提供的材料

1. 帶有 450±10 nm 濾光片的酶標儀。

2. 具有高精度和一次性槍頭的單道或多道移液器。

3. 微量離心管。

4. 去離子水或蒸餾水。

5. 吸水紙吸干微孔板。

6. 清洗液容器。

7. 0.01 mol/L（或 1x）磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS)，pH 7.0-7.2。

 儲存

所有試劑均應按照小瓶上的標簽保存。校準品、檢測試劑 A、檢測試劑 B 和 96 孔板條接收后應在-20 ℃ 下儲存，其他板條應在 4 ℃ 下儲存。未使用的板條應保存在密封袋中，并提供干燥劑，以盡量減少暴露于潮濕空氣。開封的檢測試劑盒將在 1 個月內保持穩(wěn)定，前提是按照上述方法儲存。

測試原理

本試劑盒中提供的微孔板已用 CKMB 特異性抗體預包被。然后用 CKMB 特異性生物素結合抗體將校準品或樣本加入適當的微孔板孔中。然后，將偶聯(lián)辣根過氧化物酶 (HRP) 的抗生物素蛋白加入到每個微孔板小孔中并孵育。加入 TMB 底物溶液后，僅含 CKMB、生物素結合抗體和酶結合抗生物素蛋白的微孔顯示顏色變化。酶-底物反應終止  by  的  添加  of  硫酸的  酸  溶液  和  的  顏色  變更  is  采用分光光度法在 450 nm±10 nm 波長處測定。然后通過比較樣本的 O.D. 與校準曲線，測定樣本中 CKMB 的濃度。

 樣本采集和儲存

血清

使用血清分離管，使樣本在室溫下凝結 2 小時或在 4 °C 下過夜，然后以約 1,000 xg 離心 20 min。立即測定新鮮制備的血清或將等份樣本儲存在-20 °C 或-80 °C 下備用。避免反復凍融循環(huán)。

血漿

使用 EDTA 或肝素作為抗凝劑采集血漿。采集后 30 min 內，在 4 ℃ 下以 1,000 xg 離心樣本 15 min。立即取出血漿并測定，或將等分樣本儲存在-20 °C 或-80 °C 備用。避免反復凍融循環(huán)。

組織勻漿

組織勻漿的制備因組織類型而異。

1. 在冰冷 PBS 中沖洗組織，*除去過量血液，并在勻漿前稱重。

2. 將組織切成小塊，并在冰上用玻璃勻漿器（Micro tissue Grinders works，也是如此）在新鮮裂解緩沖液（需要根據目標蛋白的亞細胞位置選擇不同的裂解緩沖液）（w:v = 1:20-1:50，例如在 20-50 mg 組織樣本中加入 1 mL 裂解緩沖液）中勻漿化。

3. 用超聲細胞破碎儀對所得混懸液進行超聲處理，直至溶液澄清。

4. 然后，勻漿以 10,000×g 離心 5 min。立即收集上清液并進行測定，或等分并在≤-20 ℃ 下儲存。

細胞裂解物

根據以下說明進行測定前，需要裂解細胞。

1. 貼壁細胞應用冷 PBS 輕輕洗滌，然后用胰蛋白酶分離，1 000 xg 離心 5 min 收集（懸浮細胞可直接離心收集）。

2. 在冷 PBS 中清洗細胞三次。

3. 在濃度為 10 的新鮮裂解緩沖液中重懸細胞⁷ 細胞/mL。 If it is 必要， 的 細胞 可能是 接受 to 超聲處理 至 的 溶液 is 澄清。

4. 在 4 °C 下以 1,500 xg 離心 10 min，除去細胞碎片。立即測定或等分并在≤-20 ℃ 下儲存。

細胞培養(yǎng)上清液和其他生物體液

以 1,000 xg 離心樣品 20 min，立即收集上清液并進行測定，或將等份樣品儲存在-20 °C 或-80 °C 備用。避免反復凍融循環(huán)。

 注：

1. 5 天內使用的樣品可在 4<unk>C 下儲存，否則樣品必須在-20<unk>C（≤1 個月）或-80<unk>C（≤2 個月）下儲存，以避免失去生物活性和污染。

2. 進行試驗時，將樣品恢復至室溫。

3. 樣本溶血會影響結果，因此不應使用溶血標本。

4. 根據我們內部數據量，強烈建議使用血清代替血漿進行檢測。

試劑制備

使用前，將所有試劑盒組分和樣本恢復至室溫 (18-25 ℃)。如果試劑盒不能一次性用完，請只取出試紙條和試劑進行現實驗，剩余試紙條和試劑留作所需條件。

校準品

用 1.0 mL 校準品稀釋液復溶校準品，室溫下放置 10 min，輕輕振搖（不得起泡）。儲備液中校準品的濃度為 200 ng/mL。請先將原液稀釋至 100 ng/mL，稀釋后的校準品作為高濃度校準品 (100 ng/mL)。然后準備 7 個含有 0.5 mL 校準品稀釋液的試管，根據下圖，使用經稀釋的校準品制備雙倍稀釋系列。在下一次轉移前，充分混勻各試管。設置 7 個稀釋校準品點，例如 100 ng/mL、50 ng/mL、25 ng/mL、12.5 ng/mL、6.25 ng/mL、3.12 ng/mL、1.56 ng/mL，后一個含有校準品稀釋液的 EP 管為空白，濃度為 0 ng/mL。

檢測試劑 A 和檢測試劑 B

使用前短暫離心或離心儲備液檢測 A 和檢測 B。分別用試驗稀釋劑 A 和 B 將其稀釋至 100 倍工作濃度。

清洗液

用 580 mL 去離子水或蒸餾水稀釋 20 mL 濃縮液 (30X)，制備 600 mL 清洗液 (1X)。

TMB 底物

用無菌吸頭吸取所需劑量的溶液，不得將殘留溶液再次倒入小瓶中。

注：

1. 在測定前 15 min 內制備校準品。請勿在 37 ℃ 下溶解試劑°C 直接。

2. 不允許在微孔中直接進行連續(xù)稀釋。

3. 請按照說明仔細復溶校準品或工作檢測試劑 A 和 B，避免起泡并輕輕混合，直至晶體*溶解。為盡量減少移液造成的不精密度，使用小體積并確保移液器經過校準。建議一次移液抽吸 10 μL 以上。

4. 重組校準品、檢測試劑 A 和檢測試劑 B 只能使用一次。

5. 如果在清洗濃縮液 (30X) 中形成晶體，則加熱至室溫并輕輕混合，直至晶體*溶解。

6. 污染的水或試劑配制容器會影響檢測結果。

樣品制備

1. 我們僅對試劑盒本身負責，而不對測定過程中消耗的樣本負責。用戶應計算整個檢測中可能使用的樣本量。請?zhí)崆邦A留足夠的樣本。

2. 請在測定前預測濃度。如果這些值不在校準曲線范圍內，則用戶必須確定其特定實驗的宜樣本稀釋度。應使用 PBS 稀釋樣本。

3. 如果手冊中未指明樣本，則有必要進行初步實驗以確定試劑盒的有效性。

4. 通過化學裂解緩沖液制備的組織或細胞提取樣本，由于某些化學物質的影響，可能會導致意外的 ELISA 結果。

5. 由于其他來源的抗原和我們試劑盒中使用的抗體之間可能存在錯配（例如，抗體靶向構象表位而不是線性表位），一些來自其他生產商的天然或重組蛋白可能無法被我們的產品識別。

6. 受細胞活力、細胞數量或取樣時間等因素影響，試劑盒可能無法對細胞培養(yǎng)上清液樣本進行檢測。

7. 建議使用未經長期儲存的新鮮樣本進行試驗。否則，這些樣品可能發(fā)生蛋白質降解和變性，終導致錯誤結果。

分析方法

1. 測定稀釋校準品、空白和樣品的微孔。校準品制備 7 孔，空白制備 1 孔。向適當的孔中分別加入 100µL 校準品稀釋液（讀取試劑制備）、空白和樣本。用封板覆膜覆蓋。在 37 ℃ 下孵育 1 小時。

2. 清除各孔中的液體，不要清洗。

3. 向各孔中加入 100µL 檢測試劑 A 工作液，用封板覆膜覆蓋孔，并在 37 ℃ 下孵育 1 小時。

4. 吸取該溶液，并使用噴霧瓶、多通道移液器、歧管分配器或自動洗滌器用 350µL 1X 清洗液清洗每個孔，并靜置 1-2 min。通過將微孔板卡在吸水紙上，*去除所有微孔中的剩余液體?？偣睬逑?3 次。后一次洗滌后，通過抽吸或傾倒除去任何剩余的洗滌緩沖液。倒置平板，在吸水紙上吸干。

5. 向各孔中加入 100µL 檢測試劑 B 工作液，用封板覆膜覆蓋孔，并在 37 ℃ 下孵育 30 min。

6. 按照步驟 4 重復抽吸/清洗過程共 5 次。

7. 向各孔中加入 90µL 底物溶液。用新封板覆膜覆蓋。在 37 ℃ 下孵育 10-20 min（不得超過 30 min）。避光保存。加入底物溶液后液體將變藍。

8. 向各孔中加入 50µL 終止液。加入終止液后，液體將變黃。輕敲微孔板側面，混合液體。如果顏色變化不均勻，輕輕敲擊平板以確保充分混合。

9. 取下平板底部的水滴和指紋，確認液體表面無氣泡。然后運行酶標儀，立即在 450 nm 處測定。

注：

1. 試驗準備：每次實驗保留適當數量的孔，并從微孔板中取出額外的孔。其余孔應重新密封并儲存在-20 ℃ 下。

2. 樣本或試劑添加：請使用新鮮制備的校準品。請小心地向孔中加入樣品并輕輕混合以避免起泡。請勿觸摸孔壁。對于程序中的每個步驟，向測定板中加入試劑或樣品的總分配時間不應超過 10 min。這將確保每個移液步驟的運行時間相等，不會中斷。建議重復檢測所有校準品和樣本，盡管不是必需的。為避免交叉污染，在添加校準品、樣本和試劑之間更換移液器吸頭。此外，每種試劑使用單獨的儲液器。

3. 孵育：為確保結果準確，孵育步驟期間必須適當粘附封板覆膜。在孵育步驟之間，不得使孔長時間處于未覆蓋狀態(tài)。試劑加入微孔板條后，在測定過程中的任何時間都不要讓板條變干。必須控制孵育時間和溫度。

4. 清洗：清洗程序至關重要。在每個步驟中*去除液體對于良好性能至關重要。后一次洗滌后，通過抽吸或傾倒除去任何剩余的清洗液，并除去平板底部的任何水滴和指紋。清洗不充分將導致精密度較差和吸光度讀數假性升高。

5. 反應時間的控制：觀察加入 TMB 底物后顏色的變化（如每 10 min 觀察一次），如顏色過深，應提前加入終止液，避免反應過強，導致吸光度讀數不準確。

6. TMB 底物容易被污染。請避光保存。

7. 低于 60% 的環(huán)境濕度可能會對終性能產生一些影響，因此，建議在該條件下使用加濕器。

結果計算

計算每個校準品、質控品和樣本的重復兩次讀數的平均值，并減去平均零校準品光密度。通過繪制每份校準品的平均 od 值和濃度，構建校準曲線，并通過該曲線圖上的點繪制適合擬合曲線，或在對數-對數曲線圖紙上以 CKMB 濃度為 y 軸，以吸光度為 x 軸，創(chuàng)建校準曲線。還建議使用一些 plot 軟件。如果樣本已被稀釋，則從校準曲線讀取的濃度必須乘以稀釋因子。

性能

檢測范圍

1.56–100 ng/mL。

用于 ELISA 的校準曲線濃度為 100 ng/mL、50 ng/mL、25 ng/mL、12.5 ng/mL、6.25 ng/mL、3.12 ng/mL、1.56 ng/mL。

 靈敏度

CKMB 的小可檢測劑量通常低于 0.67 ng/mL。

該試驗的靈敏度或檢測下限 (LLD) 定義為可與零區(qū)分的低蛋白濃度。通過將 20 次零校準品重復測定的平均光密度值加上兩個標準差并計算相應的濃度來確定。

專屬性

該方法檢測 CKMB 具有較高的靈敏度和*的特異性。

分析方法總結

1. 準備好所有試劑、樣本和校準品；

2. 向各微孔中加入 100 μL 校準品或樣本。37 °C 下孵育 1 小時；

3. 吸出并加入 100 μL 制備的檢測試劑 A。在 37 ℃ 下孵育 1 小時；

4. 抽吸并清洗 3 次；

5. 加入 100 μL 制備好的檢測試劑 B，37 °C 孵育 30 min；

6. 抽吸并清洗 5 次；

7. 加入 90 μL 底物溶液。37 °C 下孵育 10-20 min；

8. 加入 50 μL 終止液。立即在 450 nm 處讀數。

重要說明

1. 終實驗結果將與產品的有效性密切相關，因此試劑盒應在失效日期前使用。請嚴格按照說明儲存試劑盒。

2. 不同批次試劑盒的檢測范圍、靈敏度和顯色時間可能略有不同。請嚴格按照試劑盒隨附說明書進行實驗，本公司網站電子版僅供參考。

3. 請勿將不同批次試劑盒中的試劑混合或替代。僅使用制造商提供的試劑。

4. 儲存和孵育期間，所有試劑均應避免強光照射。所有試劑瓶蓋均應蓋緊，防止微生物的蒸發(fā)和污染。TMB 底物應保持無色，直至與結合微孔板的酶反應。

5. 首次開板時孔內可能有一些霧狀物質。對終試驗結果無任何影響。在需要之前，請勿從儲存袋中取出微孔板。

6. 試劑制備和加載過程中的錯誤操作，以及酶標儀參數設置不正確可能導致結果不正確。帶寬為 10 nm 或更低，在 450±10 nm 波長下光密度范圍為 0-3 O.D. 的酶標儀可用于吸光度測量。實驗前請仔細閱讀說明書并調整儀器。

7. 樣品制備和實驗操作的每個步驟的變化可能導致不同的結果。為了獲得更好的重現性結果，應控制試驗中每個步驟的操作。

8. 每個套件均已嚴格通過 Q.C 測試。然而，由于一些非預期運輸條件或不同的實驗室設備，終端用戶的結果可能與我們的內部數據不一致。不同批次試劑盒之間的試驗內差異也可能由上述因素引起。

9. 來自不同制造商的具有相同項目的套件可能產生不同的結果，因為我們尚未將我們的產品與其他制造商進行比較。

10. 用于抗體制備的試劑盒校準品和免疫原通常為重組蛋白，由于重組蛋白制備中可能會用到不同的片段、表達系統(tǒng)、純化方法等，我們無法保證試劑盒能夠檢測到其他公司的重組蛋白。所以，不建議使用試劑盒進行重組蛋白的檢測。

11. 請預測樣本中目標分子的濃度，或者安排預實驗，是解決具體問題的好方法，例如樣本的濃度超出試劑盒的檢測范圍。

12. 由于其有效性的不確定性，該試劑盒可能不適用于檢測一些特殊實驗的樣本，例如基因敲除實驗。

13. 建議與該試劑盒一起使用的終止液是一種酸性溶液。使用本材料時，請佩戴眼睛、手、面部和防護服。

僅供研究使用。

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