orimabs技術領域

重組蛋白制備
 

為了產生抗體，一步是制備重組抗原蛋白。我們擁有用于重組蛋白表達的三個表達平臺，包括哺乳動物細胞（CHO和HEK293無血清系統(tǒng)），酵母和大腸桿菌表達系統(tǒng)。

對于人類抗原，哺乳動物表達系統(tǒng)是理想的表達系統(tǒng)，因為其重折疊和翻譯后修飾（例如糖基化）接近天然抗原。在大多數情況下，細胞表面抗原的細胞外結構域（例如腫瘤標志物）是抗體生成的目標域。需要制備細胞外結構域的重組蛋白，而不是完整的表面蛋白（包括單個或多個跨膜和細胞內結構域）。然而，部分地由于其天然易位方式的改變而僅表達天然蛋白的一部分是非常具有挑戰(zhàn)性的。為了克服這個問題，我們開發(fā)了幾種新穎的哺乳動物表達載體，它們能夠使這種困難表達蛋白高水平表達。
 

抗原高表達細胞系的建立
 

有時為了確保用于文庫篩選的抗原處于其天然構象，我們使用抗原陰性和陽性細胞系來篩選文庫。我們有一個慢病毒表達系統(tǒng)來創(chuàng)建抗原高表達細胞系?？乖母弑磉_與細胞內EGFP的表達有關，因此可以通過熒光激活細胞分選術（FACS）純化高表達的細胞。

酵母菌展示

酵母展示是一種用于抗體發(fā)現的新開發(fā)技術。與噬菌體展示相比，酵母展示具有以下優(yōu)勢：真核表達，利用FACS分選來選擇性分離不同親和水平群體的能力以及方便地通過FACS檢測抗原結合，這使得酵母展示成為發(fā)現新抗體的有力工具。

然而，很大程度上由于酵母轉化效率低而構建大的酵母展示抗體文庫是非常具有挑戰(zhàn)性的。我們開發(fā)了一種技術，可使酵母轉化效率比傳統(tǒng)方法提高1000倍，從而有可能有效地構建大型酵母展示抗體庫。

除了優(yōu)化酵母轉化效率外，我們還開發(fā)了新穎的酵母展示載體，可以在單體或二聚體中展示scFv，具有*的標簽和接頭，可有效克隆，展示，檢測和保護scFv的結構和功能不受影響由共表達的AGA2蛋白和標簽組成（圖1）。 

如果將分離的scFv的終目標工程化為二聚體，例如scFv-Fv或完整抗體，則建議使用二聚體scFv庫，因為高親和力單體scFv可能不會轉化為高親和力的二聚體。如果scFv是終的抗體形式，例如標記納米顆?；蜷_發(fā)基于scFv的成像探針，則建議將單體scFv顯示庫用于scFv分離。有時抗原只有很小的口袋抗原決定簇，這很可能在小肽抗原中觀察到，全尺寸的scFv太大而無法適合小的口袋抗原決定簇，一個僅包含VH或VL的單結構域文庫將是理想的屏幕。

我們還開發(fā)了一種使用重組蛋白，標簽融合蛋白或基于細胞的篩選的綜合文庫篩選策略（圖1）。從文庫分離的scFv親和力通常在單體的納摩爾范圍內，并且當被工程化以進行調光時，例如scFv-Fc或完整抗體，親和力通常將增加約10倍。
 

插圖1：酵母顯示的二聚體和單體scFv。

圖1：基于細胞的酵母展示抗體文庫淘選。

噬菌體展示

酵母展示對于Fab文庫的構建是具有挑戰(zhàn)性的，因為很難以適當的比率同時表達VH和VL / VK兩者以使VH和VL / VK之間100％偶聯。因此，我們的Fab文庫是使用噬菌體展示構建的。OriMAbs已開發(fā)出用于Fab庫構建的噬菌體展示系統(tǒng)。兩組噬菌粒，pDCK1和pDCK1.1；以及pDCL1和pDCL1.1分別設計用于κ和λ鏈Fab展示。兩種載體均具有IgG1 CH1恒定區(qū)，并且所有恒定區(qū)均已針對大腸桿菌進行了密碼子優(yōu)化。表達和所有酶被設計為方便消化和有效克隆。噬菌粒pDCK1和pDCL1也可以用于scFv展示，其中，接頭中的酶位點也被優(yōu)化以確保翻譯的接頭對于VH和VL之間的有效偶聯是靈活的。

酵母展示人類天真的調光器-scFv庫

使用*的技術和新穎的展示載體pYDS2（展示調節(jié)劑scFvs），OriMAbs從B淋巴細胞中分離出了1x1011酵母展示調節(jié)劑scFv庫，該B淋巴細胞來自于56例健康供體的5升外周血。總共分離出6.9 mg總RNA，并從中純化了125.3 mg mRNA，并使用能夠挽救所有人類抗體庫的新型引物用于逆轉錄和VH，VK和VL擴增。ScFv在釀酒酵母上以較暗的方式顯示EBY100通過AGA1和AGA2之間的相互作用使細胞表面應變。在測序的24個克隆中，所有克隆均包含scFv基因，其中83.3％具有單個scFv基因，16.7％具有2個scFv基因。Flag標簽在100％克隆中表達，而V5標簽在83.3％（20/24）克隆中表達（圖2）。V5標簽表達失敗是由于scFv基因發(fā)生移碼突變，可能是種系中編碼截短抗體或PCR引入的真實序列（3/24）或構象障礙（1/24）。通過磁選和流選與該文庫隔離（圖3）。建議將該庫用于scFv發(fā)現，以便將scFv工程化為二聚體，例如scFv-Fc或完整抗體。
 

圖2：在24個酵母克隆中的V5表達顯示了人類天然的scFv文庫。紅色：陰性對照；藍色：V5標簽表達

圖3：在24個酵母克隆中的標志表達顯示了人類天然的scFv文庫。紅色：陰性對照；藍色：標志標記表達

酵母展示人類天真單體-scFv庫

還使用不同的酵母展示載體pYDS1和相同的VH，VK和VL基因構建了酵母展示的人類天然單體scFv庫，用于二聚體-scFv庫的構建。庫大小為1.2×10 ^ 11。建議將該庫用于scFv發(fā)現，因為scFv將是應用程序的終格式。

酵母展示人類天真的單域庫

還使用酵母展示載體pYDS1和相同的VH，VK和VL基因構建了酵母展示人類樸素單域文庫，用于單體或二聚體-scFv文庫的構建。庫大小為5×10 ^ 9。推薦該文庫用于發(fā)現只有小口袋表位的抗原的單域抗體。
 

噬菌體展示人類天然Fab庫

我們使用分離自56個健康供體的相同5 L外周血的VH和VL池，使用載體pDCK和pDCL（kappa：lambda = 2：1）構建了2×1010 Fab噬菌體展示文庫。評估的12個克隆顯示100％VK / VL插入和91.6％（11/12）VH插入。
 

從酵母展示文庫中發(fā)現抗體

我們還開發(fā)了一種使用重組蛋白，標簽融合蛋白或基于細胞的篩選的綜合文庫篩選策略（圖1）。庫平移包括2-3輪磁選，然后是2-3輪精細流選。排序的高親和力酵母展示群體可直接使用流式細胞儀進行個體克隆鑒定，或轉化為分泌型scFv亞庫，并使用高通量ELISA進行個體克隆鑒定。鑒定出的scFv將被表達和純化以用于表征，例如親和力測量和插入分析，然后進入下游工程流程。從文庫中分離出的scFv親和力在單體中通常處于納摩爾范圍內（圖4），通常在經過調光后，親和力會增加約10倍，
 

圖4：樣品scFvs a和b的親和力測量。

通過噬菌體庫淘選抗體

我們已經開發(fā)了固相和液相的噬菌體展示文庫淘選。直接在固相（例如ELISA板或免疫管）上的抗原包被可能會使抗原構象變形，結果可能丟失一些表位，從而降低分離的抗體的多樣性，或者分離的抗體可能根本不結合天然構象抗原。為了克服這個潛在的問題，我們已經開發(fā)液相淘選法，其中，無論是抗原和抗體在其天然構象?？乖Y合的噬菌體群體將通過磁選分離，分離的可溶性Fab抗體將在大腸桿菌中產生。
 

抗體工程

從抗體庫中分離的單結構域抗體，scFv或Fab抗體通常需要進行工程改造以用于不同的目的，例如，可以將它們改造為scFv-Fc或全抗體，以實現更高的親和力，更好的穩(wěn)定性和更長的循環(huán)時間。我們提供所有已知格式的抗體的設計和工程改造，例如scFv，二聚體scFv，Fab，F（ab'）2，單結構域抗體，scFv-Fc和全抗體。

親和力成熟

通常，從我們的文庫中分離出的抗體具有納摩爾范圍的親和力，當工程化為二聚體時，親和力將增加約10倍。因此，從我們的文庫生成的抗體通常不需要親和力成熟。如果需要更高的親和力，我們可以選擇通過酵母和噬菌體展示技術進行親和力成熟。

酵母展示的優(yōu)勢在于，可以使用熒光輔助細胞分選術（FACS）輕松對抗原結合的酵母菌群進行分選，因為酵母菌的大小足以被FACS識別。這使酵母菌的展示比噬菌體在親和力成熟方面更有效，因為除了用于噬菌體展示的抗原濃度管理和嚴格洗滌之外，FACS在直接將高親和力酵母種群從其他培養(yǎng)基轉化為高親和力酵母菌方面更有效（圖xx） 。

圖5：用于抗原結合的高親和力酵母群體的流式分選。

抗體生產

我們已經開發(fā)了用于抗體表達的表達系統(tǒng)，包括用于以細胞內或分泌形式表達單結構域抗體，scFv和Fab的大腸桿菌系統(tǒng)；用于單結構域抗體，scFv和Fab分泌表達的酵母系統(tǒng); 和用于所有片段抗體和全抗體的分泌表達的哺乳動物系統(tǒng)。我們提供通過這些表達系統(tǒng)生產和純化所有抗體形式的服務。
 

抗體藥物偶聯物

抗體藥物偶聯物（ADC）是一種新興的抗體治療技術。抗體（通常是全抗體）通過可裂解或不可裂解的連接子用超毒性藥物（例如MMAE，MMAF和DM1）標記，以特異性地向抗原陽性細胞傳遞毒性。死細胞釋放的毒素（MMAE和DM1）也可以通過旁通機制進入并殺死附近的抗原陽性細胞。我們提供與這些藥物結合的完整抗體和相關特性的服務。 
 

雙特異性抗體

雙特異性抗體（一個臂使用抗CD3抗體靶向T細胞，另一臂使用腫瘤特異性抗體靶向腫瘤細胞）充當將T細胞和腫瘤細胞結合在一起并激活T細胞殺死腫瘤的橋梁。我們提供設計，構建，表達和評估雙特異性抗體的服務。

光學成像的抗體標記

光學成像是一種用于體內抗體生物分布研究的方便且有用的方法，例如小鼠中的抗原表達譜研究，小鼠模型中的腫瘤靶向評估。由于近紅外（NIR）染料在組織中的深度滲透（大約1 cm），因此常用于這些研究。我們提供與這些染料和相關表征有效結合和純化片段抗體或完整抗體的服務。